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本文標題："熒光蛋白嵌合體通常在N端或C端加入融合結構"
新聞來源：未知 發(fā)布時間：2017-3-13 1:07:00 本站主頁地址：http://m.vndmy.cn
熒光蛋白嵌合體通常在N端或C端加入融合結構
程是相似的。熒光蛋白嵌合體通常在N端或C端加入融合結構。2．
獲取目的蛋白N端或C端結構一功能的知識將有助于避免干擾母體蛋
白的功能和／或
定位。而且，了解每個末端表達定位的亞細胞環(huán)境對嵌合體的設
計將是有用的。例
如，如果可能的話，避免把GFP加入到酸性蛋白水解環(huán)境中的蛋
白末端(如溶酶體
內腔)，如果沒有相關知識，最初可制備N端和C端都連接GFP的嵌
合體。3a．末端插入連接子：如果N端和C端都包含決定目標蛋白功
能和定位的結構域，則
在它和熒光蛋白之間插入短的連接肽以減少位阻的影響。3b．
包埋插入：也可以把熒光蛋白插入到分子的基本序列中，通常在未
結構化的環(huán)形
區(qū)域內。如果其他方法失敗可考慮此種方法，但不能保證成功
。4．某些情況下，把編碼熒光蛋白的eDNA插入含有編碼目標蛋白D
NA的質粒更容易。
此時，根據(jù)目標蛋白是N端融合還是C端融合，應格外注意熒光蛋
白的5’端和
3’端。5．如果產生的是N端融合(指GFP連接到目標蛋白的N端)
，貝Ⅱ必須合理設計GFP
編碼區(qū)域的兩個末端。把Kozak序列和GFP翻譯起始密碼子結合起
來將會保證
mRNA的高效翻譯，同時應該刪除GFP的終止密碼子或者將其轉化
成編碼氨基酸。6．如果產生的是C端的融合，則刪除目標蛋白的終
止密碼，或者將其轉化為一個編碼
氨基酸；保存GFP的終止密碼子。7．另外也可以把編碼目標蛋白
的cDNA插入到含有編碼熒光蛋白DNA的質粒中。在
很多情況下，這種方法更簡單，因為許多可以表達熒光蛋白的質
�？梢再I到。這些
質粒通常包含一個巨細胞病毒(CMV)連接的早期啟動子(在哺乳動
物細胞內高效
表達)，一個包含了許多獨特的限制性核酸內切酶識別位點的多
克隆位點(MCS)
(促進嵌合體的產生)，一個可使質粒在細菌種選擇性擴增的具抗
生素抗性的區(qū)域，
通常包括G418篩選基因。與上面所描述的熒光蛋白的插入一樣，
目標蛋白插入到
這些質粒中也具有同樣的限制。8．如果產生的是C端融合，則把
目標蛋白的eDNA插入到一個熒光蛋白編碼序列的5’
端含有MCS的質粒中。刪除目標蛋白的終止密碼子，或者將其轉
化為一個編碼氨基
酸，插入一個含有目標蛋白翻譯密碼子的Kozak序列。9．如果產
生的是N端融合，則把目標蛋白的eDNA插入到一個熒光蛋白編碼序
列3’端
含有MCS的質粒中(熒光蛋白編碼區(qū)的翻譯起始段含有Kozak序列)
。刪除熒光蛋
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