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本文標題："實驗步驟-免疫細胞化學染色法之單一染色"
新聞來源：未知 發(fā)布時間：2012-11-12 16:47:18 本站主頁地址：http://m.vndmy.cn
實驗步驟-免疫細胞化學染色法之單一染色
免疫細胞化學染色法 ( immunocytochemistry)
單一染色
利用單一免疫細胞化學染色法（immumocytochemical staining）可鑒定本實驗
培養(yǎng)之混合神經(jīng)膠質(zhì)細胞的型態(tài)、種類及組成比例。以 anti-glial fibrillary acidic
protein（anti-GFAP）辨示星狀膠質(zhì)細胞（asatrocytes），由于星狀膠質(zhì)細胞含有豐
富的 glial fibrillary acidic protein 故被染上的星狀膠質(zhì)細胞，在顯微鏡下可看到一
絲一絲的 glial fibrillary acidic protein。而用于辨示微小膠質(zhì)細胞（microglia）的有
anti-ED1、anti-OX6、anti-OX42；anti-ED1 可辨示微小膠細胞細胞質(zhì)內(nèi)的溶小體
（lysosome）一般而言，anti-ED1 可標示的是活化態(tài)的微小膠質(zhì)細胞，但離體實
驗（in vitro）對微小膠質(zhì)細胞而言，就會稍微使得微小膠質(zhì)細胞被活化但其活化
的程度與給 LPS 處理后相較仍有程度上之差異；從 anti-ED1 染色可看到給予 LPS
處理的微小膠質(zhì)細胞其外形變得比較圓、幾乎看不到突起的觸角（process）而無
給予 LPS 處理的微小膠質(zhì)細胞亦可被標示到，但顯微鏡下可看到其外形較細長、
仍可清楚看到突起的觸角。anti-OX6 辨示活化狀態(tài)之微小膠細胞細胞膜上 MHC
class II 的接受器。而 anti-OX42 可辨示微小膠質(zhì)細胞細胞膜上 CR III 接受器，不
論微小膠質(zhì)細胞是否被活化都可被 anti-OX42 標示到。當微小膠質(zhì)細胞被活化
時，其型態(tài)會由靜止狀態(tài)（resting stage）變成活化狀態(tài)（activated stage），即細胞
的外觀會由不規(guī)則的、細長的外形且可看到突起的觸角慢慢轉(zhuǎn)變?yōu)橥庑屋^圓、突
起的觸角逐漸縮短的型態(tài)，稱為（amoeboid）
實驗步驟
1. 將細胞種于置有玻片的 24 孔培養(yǎng)盤中，定期更換新鮮培養(yǎng)液至可實驗狀態(tài)。
藥物處理后的細胞以 PBS（1X、pH＝7.4）清洗二次（10 分鐘 / 次）后，加
入 4% paraformaldehyde 置于室溫下二十分鐘以固定細胞，之后移除
paraformaldehyde 再以 0.05M TBS（pH=7.6）清洗細胞。
2. 加入 3% H2O2 于 0.05M TBS，置室溫下作用三十分鐘以去除內(nèi)生性過氧化酵素
（endogenous peroxidase）。
3. 以 0.05M TBS 清洗細胞三次，移除 H2O2，盡可能避免泡泡產(chǎn)生。
4. 去除非特異性的結(jié)合（nonspecific binding），將 10% normal horse serum（NHS）
或 normal goat serum（NGS）,0.1% Triton X-100 加至 0.05M TBS 混合后，加入
24 孔培養(yǎng)盤中使之足以覆蓋表面，置室溫下一小時。
5. 移除 NHS 或 NGS，以 0.05M TBS 清洗細胞三次后，加入初級抗體置于 4℃過
夜反應。
6. 移除初級抗體，以 0.05M TBS 清洗細胞三次后，加入次級抗體于室溫下反應
一小時。
7. 移除次級抗體，以 0.05M TBS 清洗細胞三次后，加入 peroxidase-conjugated
streptavidin 于室溫下反應三十分鐘。
8. 移除 peroxidase-conjugated streptavidin，以 0.05M TBS 清洗細胞三次后，加入
DAB（5% DAB+1% H2O2）作呈色反應
9. 對比染色
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