不同濃度的乙基雌性激素的酵母菌細(xì)胞增生測試

于15mL離心管中加入3 mL培養(yǎng)液(SD medium-His)，自培養(yǎng)皿上刮取少許酵母菌加入培養(yǎng)液中，混合均勻，至于orbital shaker上培養(yǎng)隔夜。

以絕對(duì)酒精配制100 ppb 及10 ppb乙基雌二醇。

取10 m L絕對(duì)酒精、10 ppb雌二醇20 m L、50 m L ，100 ppb乙基雌二醇10 m L、20 m L、50 m L至100 mL血清瓶中，各三重複，待酒精揮發(fā)至乾，加入2 mL SD-medium-His-Ura培養(yǎng)液。此試驗(yàn)雌二醇最終濃度為0.1、0.25、0.5、1.0、2.5 ppb。

取10 m L 絕對(duì)酒精至100 mL血清瓶中，各三重複，待酒精揮發(fā)至乾，加入10 mL SD-medium-His培養(yǎng)液。作為此次試驗(yàn)的正控制組。

以121 ℃、15分鐘將上述培養(yǎng)液滅菌，待冷卻至室溫。

將前一日培養(yǎng)的酵母菌，移植至上述培養(yǎng)液，經(jīng)16、24、40、48小時(shí)取100 m L進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

低濃度的乙基雌性激素的酵母菌細(xì)胞增生測試

于15mL離心管中加入3 mL培養(yǎng)液(SD medium-His)，自培養(yǎng)皿上刮取少許酵母菌加入培養(yǎng)液中，混合均勻，置于軌道震盪器上培養(yǎng)隔夜。

以絕對(duì)酒精配制乙基雌二醇，濃度為0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50、100、200、500 ppb，取10 m L加至100 mL血清瓶中，各三重複，待酒精揮發(fā)至乾，加入10 mL SD-medium-His-Ura培養(yǎng)液，使乙基雌二醇最終濃度為0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50、100、200、500 ppn。

取10 m L 絕對(duì)酒精至100 mL血清瓶中，各三重複，待酒精揮發(fā)至乾，加入10 mL SD-medium-His培養(yǎng)液。作為此次試驗(yàn)的正控制組。

以121大氣壓、15分鐘將上述培養(yǎng)液滅菌，待冷卻至室溫。

將前一日培養(yǎng)的酵母菌，移植至上述培養(yǎng)液，經(jīng)24小時(shí)取100 m L進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

四、結(jié)果

酵母菌細(xì)胞數(shù)之定量分析

將滅菌之培養(yǎng)液以分光光度計(jì)由波長360 nm至波長800 nm每隔20 nm讀一次吸光值觀察此培養(yǎng)液在此波長范圍內(nèi)有無特殊之吸光值，其結(jié)果如圖一所示；培養(yǎng)PL3之酵母菌液的結(jié)果如圖二所示。

由圖一與圖二所見，酵母菌的培養(yǎng)液在波長500 nm吸光值逐漸增加，而含有酵母菌之菌液隨著波長減短而吸光值逐漸增加，波長500 nm至800 nm對(duì)酵母菌個(gè)數(shù)的推估應(yīng)穩(wěn)定而合適，John Wiley 建議以波長600 nm作為推估酵母菌細(xì)胞個(gè)數(shù)的固定波長。

在顯微鏡的觀察下，酵母菌細(xì)胞為圓形顆粒，出芽生殖，常有許多細(xì)胞集結(jié)在一起，不易計(jì)數(shù)，在兩種不同濃度菌液分別測其分光光度(OD600)，在分光光度計(jì)波長在600 nm下結(jié)果如表一所示。

酵母菌液細(xì)胞個(gè)數(shù)與分光光度計(jì)吸光值線性動(dòng)態(tài)范圍

將培養(yǎng)24小時(shí)的菌液連續(xù)稀釋，以分光光度計(jì)波長600 nm 測其吸光值其結(jié)果如圖三。

酵母菌生長曲線測試

酵母菌培養(yǎng)第3、7、22、30、48、54小時(shí)觀察結(jié)果如圖四所示。

酵母菌細(xì)胞在培養(yǎng)前7個(gè)小時(shí)以顯微鏡觀察也不易看出有增長的現(xiàn)象，第22小時(shí)觀察時(shí)乙基雌二醇與陽性控制組已有增生的現(xiàn)象，至30小時(shí)后酵母菌細(xì)胞濃度不再隨時(shí)間增長而有生長的現(xiàn)象，陽性控制組一直增生至54小時(shí)，而雌二醇一直到第48小時(shí)才觀測出細(xì)胞增生的現(xiàn)象。

酵母菌初始細(xì)胞數(shù)對(duì)細(xì)胞增生測試的影響

以96孔盤觀測雌性激素對(duì)酵母菌增生情形如圖五、六，以乙基雌二醇做測試，其在波長600 nm的吸光值，空白試驗(yàn)于低細(xì)胞濃度初始值如1000或10000 cell/ well下，吸光值并沒有明顯增加，但是酵母菌細(xì)胞數(shù)濃度在50000、100000 cell/ well，即使沒有雌性激素，吸光值仍明顯高于細(xì)胞數(shù)1000 cell/ well。細(xì)胞濃度1000 cell/well在乙基雌二醇濃度0.2 ppb時(shí)有明顯吸光值，但是0.2至5 ppb吸光值無明顯差異p<0.05。細(xì)胞濃度10000 cell/well在乙基雌二醇濃度0.05 ppb時(shí)有明顯吸光值隨著乙基雌二醇濃度增加吸光值明顯增加，細(xì)胞濃度50000、100000 cell/well在乙基雌二醇濃度0.05 ppb時(shí)就有明顯吸光值。

圖六表示細(xì)胞初始濃對(duì)細(xì)胞增生試驗(yàn)的影響，以雌二醇為測試對(duì)象，細(xì)胞增生的數(shù)量比乙基雌二醇較少，初始細(xì)胞數(shù)為1000 cell/well時(shí)，除了在5 ppb略有增加，而其他濃度無增生的情形，初始細(xì)胞數(shù)過高，如5000 或100000 cell/well，均使空白組細(xì)胞有增生的現(xiàn)象，而初始細(xì)胞數(shù)10000 cell/well增生效果明顯

不同濃度的乙基雌二醇對(duì)細(xì)胞增生試驗(yàn)

以不濃度的乙基雌二醇0、0.1、0.25、0.5、1、2.5 ppb及陽性控制組進(jìn)行細(xì)胞增生試驗(yàn)，在第16、24、40、48小時(shí)進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖六所示。在第16小時(shí)增生還不明顯，第24小時(shí)除空白組與1ppb乙基雌二醇外，均有增生的現(xiàn)象，隨濃度增加，而增生量增加，但是24小時(shí)后隨時(shí)間增加而有衰減的現(xiàn)象。

低濃度乙基雌二醇對(duì)酵母菌增生試驗(yàn)

降低乙基雌二醇濃度對(duì)酵母菌增生情形進(jìn)行測試，濃度分別為0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、500、500 ppn乙基雌二醇培養(yǎng)24小時(shí)，其結(jié)果如圖七所示，一直到50 ppn才有反應(yīng)，50至500ppn以分光光度計(jì)檢測看不出有何差別。