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本文標(biāo)題："基因植入動(dòng)物細(xì)胞最常用的方法?"
基因植入動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)
此處緊介紹最常用的方法, 并以組織培養(yǎng)之單層細(xì)胞為標(biāo)的.
組織培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞, 應(yīng)注意無(wú)菌技術(shù), 為求初學(xué)者溶液著手, 以Hela細(xì)胞, 即可高溫高壓消毒的MEM培養(yǎng)液開(kāi)始, 加入10﹪的牛血清. 并加入Gentamicin sulfate(抗生素), 以防污染. 在細(xì)胞剝離培養(yǎng)器時(shí), 採(cǎi)用0.5﹪w/v的trypsin即0.2﹪w/v的EDTA液, 所有的培養(yǎng)液, 在使用前, 必須先抽出少量, 先在CO2恆溫培養(yǎng)相中培養(yǎng)至少2天, 無(wú)污染出現(xiàn), 才能使用. 在從事基因植入動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)前, 應(yīng)先熟悉動(dòng)物組織培養(yǎng), 即生長(zhǎng)曲線為必要之練習(xí). 每4小時(shí), 由12圓隔培養(yǎng)盤中, 取出一隔之細(xì)胞計(jì)數(shù), 至72小時(shí)為止. 藉此練習(xí)來(lái)熟悉無(wú)菌即培養(yǎng)技術(shù).
以Calcium Phosphate沉淀DNA于HEPES緩沖液中并使DNA植入動(dòng)物細(xì)胞法：
材 料：
生長(zhǎng)期Hela細(xì)胞
培養(yǎng)液
質(zhì)體DNA(含能在動(dòng)物細(xì)胞中表現(xiàn)之可探測(cè)基因)(每次轉(zhuǎn)植需10~50μg DNA)
2.5M CaCl2
2x HEPES-buffered saline (Hebs)
[配方]16.4g NaCl
11.9g HEPES acid
0.21g Na2HPO4
800ml dH2O
以5N NaOH調(diào)整pH至7.05
以0.45μm濾膜過(guò)濾消毒, 分別用50ml量保存在-20℃
注意：此時(shí)必須將0.5ml之2xHeBS與0.5ml之250mM CaCl2溷合, 看有否沉淀發(fā)生, 如無(wú)很細(xì)的沉淀, 則效果不佳.
Phosphate-buffered saline (PBS)
[配方] 10X保存液配方：
80g NaCl
2g KCl
11.5g Na2HPO4 7H2O
2g KH2PO4
1X的使用液配方： (pH約為7.3)
137mM NaCl
2.7mM KCl
4.3mM Na2HPO4 7H2O
1.4mM KH2PO4
37℃, 5﹪CO2恆溫培養(yǎng)箱
10cm組織培養(yǎng)皿
15ml無(wú)菌conical tube
方 法：
1. 在轉(zhuǎn)植前一日, 將細(xì)胞接種入培養(yǎng)皿, 約1：15比率稀釋完全滿佈的細(xì)胞, 加入9ml培養(yǎng)液.
2. 將要轉(zhuǎn)值得DNA, 以酒精沉淀, 并晾乾, 再溶入450μl的無(wú)菌蒸餾水中, 再加入50μl之2.5M CaCl2. (此處以酒精沉淀DNA的目的在消毒)
3. 在一個(gè)15ml的conical tube中加入500μl的2X HeBS, 此時(shí)一面以一個(gè)無(wú)菌1μl吸管向此液中打氣, 一面一滴滴的加入DNA/CaCl液, 加完后立即votex 5秒鐘.
4. 置室溫20min.
5. 將此DNA沉淀液均勻分布在組織培養(yǎng)皿之細(xì)胞上.
6. 培養(yǎng)6小時(shí), 倒去培養(yǎng)液, 以5ml之1X PBS洗細(xì)胞2次, 再加入10ml培養(yǎng)液.
7. 若為暫時(shí)性的轉(zhuǎn)植, 隔日即可取下檢測(cè). 若為培養(yǎng)穩(wěn)定之轉(zhuǎn)植細(xì)胞, 則令細(xì)胞長(zhǎng)二次分裂的時(shí)間, 在保存之.
預(yù)期結(jié)果：約10﹪的細(xì)胞可被轉(zhuǎn)植.
附注：
為能偵測(cè)基因有否植入細(xì)胞, "可探測(cè)基因"如β-galactosidase, 或螢火蟲(chóng)之luciferase基因均可使用.
在此之前, 本手冊(cè)層介紹將基因轉(zhuǎn)植入細(xì)菌的方法, 當(dāng)時(shí)所使用的為快速簡(jiǎn)易法, 但基因植入的成功率極低, 此外也已介紹CaCl2法, 在此一并將使用CaCl2來(lái)轉(zhuǎn)植細(xì)菌的方法列出, 供參考：
材 料：
LB培養(yǎng)液
E.Coli純菌
CaCl2液
[配方]60mM CaCl2
15﹪glyerol
10mM PIPES, pH7.0 (如無(wú)PIPES, 則取上二種材料配製)
可高溫高壓消毒.
LB培養(yǎng)皿含ampicillin
Plasmid DNA
方 法：
1. 將此菌E.Coli接種于50ml LB液中, 過(guò)夜37℃, (250rpm)振盪培養(yǎng).
2. 取上述E.Coli 4ml, 加入有400ml LB液之1 liter錐瓶, 37℃, 250rpm, 培養(yǎng)6小時(shí).
3. 將(2)中的E.Coli分裝在離心管中, 每支50ml, 并置冰上10min, 再離心5,000rpm, 5分鐘, 4℃.
4. 將細(xì)菌沉淀再溶于10ml, CaCl2液中, 再于4℃, 5,000rpm, 5min.
5. 再將細(xì)菌沉淀溶于10ml CaCl2液中, 置冰上30min, 再4℃, 離心5,000rpm, 5min.
6. 再將E.Coli溶于2ml CaCl2液中, 再分成250μl至微量離管中. 并保存在-70℃, 待用.
7. 取一支圓底離心管, 置冰上,加入10至25μl之plasmis DNA約10ng, 取出冷凍于-70℃的細(xì)菌, 快速在37℃解凍, 取出100μl加入含DNA的離心管中. 置冰上, 10min.
8. 將此離心管轉(zhuǎn)投入42℃水溶中, 2min, 加入1ml之LB液, 再放37℃, 250rpm, 1hr.
9. 將此轉(zhuǎn)植過(guò)的細(xì)菌, 稀釋數(shù)次, 每次以玻棒涂平盤法涂在恆溫培養(yǎng)箱, 至第二日檢視結(jié)果.